1.用靶蛋白（稀釋于 50 mM 碳酸鹽緩沖液 PH 9.0）包被反應板。*佳的濃度應該做滴度來獲得。但對于純化的抗原在1μg／ml濃度，每孔 50 μl一般情況下足夠。用薄膜覆蓋4oC孵育過夜。
2.移去抗原溶液。加入封閉液200μl／孔（PBS containing 1% BSA ａnd 0.02% azide）以封閉非特異蛋白的結合。室溫下卵育1–2小時，或4oC過夜。
3.移去封閉液。用含有0.02%疊氮化鈉的PBS漂洗一次。濕潤的反應板（孔）在密封塑料袋中4oC下可保存4周。使用前移去多余液體。
4.加入用封閉液稀釋的檢測抗體和對照 50 μl／每孔。抗體可以做一個系列稀釋以確定一個滴度或者用以前曾經用于篩選試驗的濃度，以及根據抗原含量滴度。室溫下孵育一小時。 5.用含0.05%Tween-20（Tween-20: sc-29113）PBS沖洗培養板3次。吸去多余的液體。
6.每孔加入50μl用封閉緩沖液稀釋 1:100-1:1000 倍的堿性磷酸酶標記的二抗 （ WB 用常規二抗）。*佳的抗體濃度應通過滴度來獲得。室溫下孵育1小時。
7.移去孔內液體。用含0.005%Twenn-20PBS沖洗3次并風干。
8.用二乙醇胺緩沖液 （10 mM diethanolamine, 0.5 mM MgCl2 （pH 9.5） 沖洗培養孔并移去液體。
9.用二乙醇胺緩沖液（diethanolamine buffer）稀釋底物（PNPP, sc-3720），*終濃度為1mg/ml。每孔加入50μl。反應10–20分鐘或陽性對照的405／490 吸光度約為1.0。加入50μl0.1MEDTA（EDTA: sc-29092），PH 7.5。酶標儀讀取405／490 nm 光吸收值。
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